沙眼病原体的发现
沙眼是一种古老的眼病, 世界性广泛流行, 曾是致盲首因, 严重危害人类健康。自 19世纪初, 沙眼病原问题即受到微生物界、眼科学界极大重视。
记得80年代中期读研究生时随导师出门诊，某天我在门诊手术室一上午做了5台眼科小手术，完了跟导师说：今天有点累了，做了5台手术。导师说：做这么几台小手术就叫累呢？想到解放初期，在同仁医院做住院医那几年（49-52年），在门诊上班，我几乎每天都要做20几台倒睫矫正术……..
人类沙眼最早的记录起始于公元前3400 年, 即埃及的基辅 ( Khefu)时代, 当时有记载关于沙眼临床症状的描述即倒睫症。沙眼( trachoma) 来源于古希腊语/ 粗糙, 即上睑淋巴滤泡。公元 11世纪阿拉伯医生IbncIsa认为沙眼分为 4 期, 并指出倒睫是沙眼的主要并发症, 称之为埃及眼炎。 1789至 1801年, 拿破仑率领法国军队进攻埃及归来时, 法国士兵将从埃及染上的这种疾病带入欧洲, 随后英国士兵又将该病带入英国。同样, 通过移民途径, 这种疾病又传入了美洲大陆。 1905年, 美国国会批准的修正案中规定移民进入美国前所有人都需要接受沙眼的检查[ 1] 。除了这种疾病的传染性强之外, 其与贫穷、居住拥挤、卫生条件差、缺乏足够的水源供应有关 [ 2]。
在我国沙眼也是一种古老的眼疾, 最早记载开始于黄帝内经, 古时称为/ 粟疮, 又名 椒疮, 明朝哀学渊的眼科全书记为/ 睑生风粟, 即/ 睑间积血, 年久致成风粟, 与眵粘症同, 然睑眵粘睛, 无风粟也, 故此分睑生风粟, 盖胞者上胞, 睑者下睑也。在审视瑶函等眼科书中有 粟疮者, 似疮非疹, 翻开上睑, 细颗业聚, 生于睑内, 如杨梅之状, 其肉与粟米相似, 赤白不定, 多泪难睁。至于治疗方面, 眼科龙木论、目经、银海精微等书记载有利用刀间日铲洗出血, 三、五度, 去根本即痒, 照本症点服不辍, 渐自稀疏 [ 3]。 20世纪 50 年代, 当时沙眼流行范围很广, 据世界卫生组织估计, 当时全世界有超过六分之一的人口患沙眼, 在发病率高的地区, 人口中因该病而失明的超过 1% ,视力受到严重损害的超过 10% 。据当时的调查, 我国的城市沙眼患病率约 25% ~ 30% , 农村沙眼患病率高达 80% ~ 90% , 有十人九沙之说, 其危害可想而知[ 3] 。早期无法解决沙眼问题主要是由于未查明病原体, 因此很多学者针对沙眼病原体进行研究, 主要有 3 种学说, 即病毒、细菌及立克次体感染。 1907年, 细菌学家Halberstaedter和 von Prowazek在印度尼西亚爪哇地区研究发现沙眼患者的结膜上皮细胞内有所谓包涵体存在, 在姬姆萨染色下上皮细胞质呈青蓝色, 内藏不规则的圆形深蓝色颗粒体, 典型的聚集成堆, 像帽子似的覆盖在细胞核的一端。在病变的过程中, 这些蓝色颗粒逐渐消失, 为红色的较小颗粒所代替, 推测这种包涵体就是沙眼的病原体。1910年, Lindner在沙眼患者刮下的组织中发现一种较大的两极深染的蓝色小体, 有的游离在细胞外, 有的在细胞内, 最大的可达到 1微米, 命名为始体 ( Initial body )。细胞内包涵体小时, 则多为少数的始体, 细胞内充满包涵体时, 则多为原体 ( Elementary body) [ 3] 。 1912年 Nicolle等研究证明沙眼的病原体是可以过滤的。他们采用改良的BerkefeldV滤器, 把沙眼患者的刮取物过滤, 再将滤液接种在猴眼, 使猴患上沙眼后, 又接种在一位已盲目的自愿者眼中, 结果这位被接种者也患上了沙眼, 由此得出结论: 沙眼的病原体是一种可过滤的病毒。该结果在 1935年由 Thygeson和 Proctor重新做了滤过实验, 即将沙眼患者刮下的物质研碎, 用火棉胶膜滤过, 将滤液接种在猴子眼内, 结果这只被接种的猴子患上了沙眼, 结论得以证实。同年, 他们与 Richards从患严重沙眼的印第安小孩的眼内, 刮下上皮并研碎, 破坏细胞膜后, 先用普通的粗滤纸过滤, 除去细胞碎屑, 之后再用直径 0. 6 微米小孔的火棉胶膜过滤, 将滤液分成 3份: 第 1份接种在血琼脂等培养基上, 结果为阴性, 无微生物生长; 第 2 份用离心机离心后, 取上清涂片检查, 经姬姆萨染色, 可找到很多沙眼原体; 第 3份接种于一位 50岁女性自愿者的正常眼, 先将结膜刮擦, 滴入约 1. 6 毫升滤液, 再轻轻摩擦结膜, 经过 5 天潜伏期后, 该妇女患上一种急性结膜炎, 并有大量包涵体和游离始体存在, 诊断为沙眼。 6 周后, 该女性患者角膜有典型血管翳, 结膜变化和临床经过均为典型的沙眼, 经 1年多治疗才痊愈。其后又有很多的实验证实沙眼的病原体是一种可过滤性病毒 [ 4] 。
1938年 Thygeson检查了 320例沙眼患者, 共分为 10组 (表 1), 发现在沙眼开始时 100% 可以找到包涵体, 于急性期多为原体, 并且原体的数量与疾病的轻重成正比, 而在沙眼的后期包涵体的发现率明显减少。 1951年日本学者伊藤报道用电子显微镜检查沙眼组织中取得的滤过液, 可见很多小体, 大小约 60~ 250 纳米, 5人接种该滤液, 其中 4 人感染沙眼, 因此有关沙眼的病原体被认为是滤过性病毒, 但是也有实验得出了阴性结果。 1927年日本眼科学家野口英世在新墨西哥从 5 个未经治疗的印第安人沙眼患者中分离出一种多形态的杆菌, 该菌微小而不产生芽孢, 有荚膜, 能运动, 有鞭毛, 革兰染色阴性, 长约 0. 8~ 1. 2 微米, 一端有一根鞭毛, 为兼氧性, 在半固体培养基中, pH 值 7. 8, 15~ 30度下发育良好, 其培养物可引起猴和猿的颗粒性结膜炎。由于这些细菌可引起人和动物发生类似沙眼的滤泡性结膜炎, 所以野口英世认为这种颗粒性杆菌是沙眼的直接病原。但是, 后来经过各国专家的 74 次反复实验均先后否定了野口氏颗粒性杆菌为沙眼病原体的观点, 原因是这种细菌接种在喉咽后, 虽然引起滤泡性结膜炎, 但是无瘢痕化, 并且不是每个患者中都能找到该细菌。
1934年 Thygeson曾证明包涵体和立克次体有相同的性质, Busacca认为沙眼病原体是立克次体, 定名为 R ickettsiatrachomatosa, 主要是形态学相似。Cuenod等用二期沙眼的颗粒内容移植在冰箱内保存 2 天、于无菌状态下孵化的虱, 应用 Carrels穿刺接种法, 4 天后将该虱磨碎, 用生理盐水中作成乳剂注射在一位盲人的结膜下, 5 天后该患者即发生黏膜肥厚和细小的颗粒, 其表皮刮片和泪液中有点状和小帽状的包涵体和游离的立克次体。6周后, 结膜呈现典型的第 1期沙眼症状 (未提及以后是否发生瘢痕和角膜变化 )。但是, 此后很多学者使用同样的培养方法, 结果则为阴性, 从而否定了立克次体是沙眼病原体之说。
20世纪早期眼科学家、细菌学家及病理学家都参与了对沙眼病原体的研究, 以包涵体、颗粒杆菌及立克次体为主要发现, 但是经过无数的实验和探索, 始终未能解决问题。由于在世界各地都很难找到野口氏颗粒性杆菌, 而实验的结果又多不确实, 尤其是以人类接种但并未出现沙眼的情况, 因此之后无人再探讨。立克次体也因为虱的接种不能完全成功, 而沙眼患者的威-斐反应与其他已知的立克次体疾患相差太远, 所以也被人放弃。仅包涵体学说仍被学者们认可, 但是包涵体究竟是何物, 生物还是非生物? 若是生物, 则是否为一种特别的生物? 抑或滤过性病毒或立克次体?
20世纪 30年代, 我国微生物学家汤飞凡看到沙眼对国人的危害, 即已开始了沙眼病因的研究。他和眼科周诚浒教授合作从 227例沙眼患者取材, 做了数百次细菌培养, 均未能分离出颗粒杆菌。采用野口原颗粒杆菌菌株接种 12名志愿者 (包括汤飞凡自体眼 ), 但是人体感染试验无沙眼病变,猴眼感染实验也为阴性结果; 以颗粒杆菌为抗原做凝集试验发现 沙眼患者与非沙眼患者无差别; 因此汤飞凡教授否定了沙眼病原的细菌学说。此后, 由于日本侵华战争的影响, 中断了我国沙眼研究的进程。
中华人民共和国成立以后国内烈性传染病基本控制,防疫重点转向多发、常见传染病。当时我国沙眼流行猖獗,防治问题未能解决。汤飞凡教授计划重新继续开展沙眼病因的研究, 1954年他与时任北京同仁医院眼科主任兼副院长的张晓楼教授协商共同合作, 由张晓楼教授负责临床检查、提供临床标本, 汤飞凡教授主持实验研究。他们接受前 人失败的经验, 首先从包涵体研究入手, 因为包涵体形成是病毒等细胞内寄生的微生物感染的特征, 制定了科学的采集活动期沙眼标本的方法, 即选择 201例活动性的、无并发症且未经治疗的典型沙眼病例做结膜刮片, 带回生物制品研究所实验室, 经染色后于显微镜下检查, 证实沙眼结膜刮片可查见包涵体。将包涵体阳性的沙眼材料接种到 1只健康猴子眼内, 使其感染沙眼, 证明了包涵体的感染性。在猴体感染实验中, 共接种了 6 只猴子, 其中 3 只获得阳性结果。在这 3只感染阳性的猴子中, 2只找到了包涵体。此发现纠正了以往认为猴子患沙眼不产生包涵体的错误观点 [ 5, 6]。
随后他们开展沙眼病毒的分离实验。根据1951年日本学者荒川报道小白鼠脑内注射、1953年北村用绒毛尿囊接种鸡胚的方法分离沙眼病毒, 他们从 68例沙眼患者中采集材料, 通过不同方式接种了 2500多只小白鼠, 观察发病过程和病理改变, 但结果都是阴性, 实验似乎进入了绝境。但是,汤飞凡教授认为鹦鹉热病毒是可以在鸡胚卵黄囊中生长的微生物, 沙眼病毒与其形态相似, 也可能在鸡胚卵黄囊中生长繁殖, 因此决定接种鸡胚卵黄囊分离病毒。他们分析了影响病毒分离的因素, 认为除了选择敏感动物、适宜的感染途径、慎重选择无其他并发感染或继发感染的沙眼病例外, 还需抑制杂菌生长。人结膜囊存在正常菌群, 如果在不除杂菌的情况下将标本接种鸡胚后, 细菌将大量繁殖, 在病毒生长之前鸡胚就已经死亡, 因此他们决定在标本中加入抗生素作为抑菌剂, 而当时病毒分离常采用青霉素和链霉素作为细菌抑制剂。随着鸡胚分离实验的多次重复, 他们终于在 1955年 8月 18日第 8次分离试验中分离出了 1株沙眼 / 病毒!
这是世界上第一株沙眼病毒, 被命名为 TE8, T代表沙眼,E 代表病因, 8是第 8次试验。虽然分离出病毒, 但成功率太低, 后来才知道是因为青霉素能杀死 病毒。因此, 他们改进了方法: 取消了青霉素, 加大了链霉素的量, 延长了链霉素在标本中的作用时间, 明显提高了成功率。采用改进的方法, 使病毒分离率达到了 50%，不到两个半月内又连续分离出 8株病毒, 证明试验成功。后来, 许多国家的实验室将其称为汤氏病毒。 1956 年分离出的 TE55株作为沙眼病毒的标准株, 在全世界范围使用。随后他们证明病毒能在鸡胚中继续传代, 用其感染猴能造成典型的沙眼并可找到包涵体, 能将其从猴眼里再分离出来, 得到纯培养。他们还用分级滤膜证明病毒是可过滤的, 并测出病毒颗粒直径为 120~ 200 nm [ 7-10] 。分离出沙眼/ 病毒后, 要确认这种微生物是沙眼的病原体应按照科赫定律要求: 第一, 要能从相应的病例中分离出这种微生物; 第二, 要能在体外传代培养出这种微生物; 第三, 所分离出的微生物要能在健康宿主中引起典型病变和症状; 第四, 能从接种者再分离出这种微生物。根据这个原则, 此次实验采用的是临床未经治疗的Ò期沙眼, 从鸡胚培养获得的沙眼病毒与沙眼患者的材料一样能感染猴眼, 引起特异性病变, 并能在感染的猴眼中找到包涵体和重新分离出病毒, 沙眼/ 病毒在补体结合反应上与性病淋巴肉芽肿病毒有相互交叉反应, 并且沙眼病毒抗原与沙眼患者血清起阳性反应[ 11] 。
为了进一步验证分离获得的沙眼病原体, 汤飞凡和张晓楼教授决心做自体实验, 以证明分离的病毒对人眼的致病性。 1958年 1月和 2月课题组分别将 TJ16 株病毒( 1957年 10月北京同仁医院沙眼小组分离出的病毒, 经鸡胚传 9 代后保存 10周 ) 接种于汤飞凡的左眼睑结膜内, 将 TE16株病毒 ( 1956年 9月生物研究所实验室分离出的病毒, 经鸡胚培养传 16代后保存 18个月 )接种于张晓楼的左眼睑结膜内。接种后逐日行眼部检查, 记录发病情况。结果他们的接种眼都急性发病, 表现急性滤泡性结膜炎、角膜浅层点状浸润, 伴患侧耳前淋巴腺肿大。两位科学家在患眼高度红肿、充血、流泪的病况下忍受痛苦坚持从自己病眼重复取材检验, 先后自汤飞凡病眼结膜刮片取材查包涵体 5 次, 4次阳性, 取材分离/ 病毒10次, 2次阳性; 自张晓楼病眼结膜刮片取材查包涵体 13次, 8次阳性, 取材分离/ 病毒 8 次, 4次阳性。临床发病和实验检查结果都确凿地证实了分离的沙眼/ 病毒 0为沙眼病因。接种后 23 天、41 天, 他们才分别开始治疗。张晓楼教授的左眼结膜上穹隆部从此留下了沙眼瘢痕[ 12, 13] 。 1957年由汤飞凡、张晓楼、黄元桐等署名的沙眼病毒分离成功论文在我国《微生物学报》发表后[ 8, 9, 12-14] , 震动了国际微生物学界和眼科学界。美国、英国医学代表团来华访问索取分离的毒株, 课题组送给 Spooner两株冻干保存的毒种 ( TE8和 TE55)。英国 Lister研究所沙眼研究组主任 Collier 博士将其接种鸡胚复苏了病毒, 并按照这种方法在西非冈比亚分离出 1株命名为 G1沙眼衣原体, 从此中国首次分离出的 TE8和 TE55两株毒种被送到世界各国, 成为研究沙眼病原体的标准株。由于沙眼和鹦鹉热及鼠蹊淋巴肉芽肿的病原体同属介于细菌与病毒之间的一组微生物, 1973 年国际微生物学分类将鹦鹉热-沙眼-性病淋巴肉芽肿这组长期被命名为病毒的微生物从病毒中移出, 改称衣原体目, 沙眼病毒正式改名为沙眼衣原体 ( Chlamydia trachomatis)。从此, 世界各地不断有采用中国的实验方法成功分离出沙眼衣原体的文献报道。此后每 5年世界科学界召开 1次国际性会议, 深入开展沙眼衣原体的研究。现已认识到沙眼衣原体还可引起人体其他多种部位的感染, 造成多种多样的疾病, 如男性尿道炎、附睾炎, 妇女宫颈炎、子宫内膜炎, 婴幼儿肺炎, 母婴衣原体传播等[ 15]。沙眼衣原体感染已成为一种重要的性传播疾病, 引起医学界的极大关注。总之, 沙眼病原体的发现是对医学研究领域的重要贡献, 是微生物学家和眼科学家密切合作与共同努力而创造的中国医学史上的重要成就之一。
参考文献
1 A llen SK, S emba RD. The trachom a / M en ace0 in th e Un ited
S tates, 1879-1960. Su rvOphthalmo,l 2002, 47: 500-509.
2 M ecaskey JW, Knirsch CA, Kum aresan JA, et a.l The possibility of
eliminating b lindingtrachom a. Lan cet In fect D is, 2003, 3: 728-734
3 吴文华, 沈玉清. 实用沙眼防治学. 上海卫生出版社, 1956. 617
4 邹子度. 沙眼的病原. 中华眼科杂志, 1953, 3: 90-103.
5 汤飞凡, 张晓楼, 李一飞, 等. 沙眼病原研究: I. 沙眼包涵体的研究. 微生物学报, 1956, 4: 1-14.
6 汤飞凡, 张晓楼, 李一飞, 等. 沙眼病原研究: II. 猴体传染实验. 微生物学报, 1956, 4: 15-23.
7 李一飞, 卢宝兰, 张晓楼, 等. 沙眼病原研究: III. 病毒分离试验. 微生物学报, 1956, 4: 25-32.
8 汤飞凡, 张晓楼, 黄元桐, 等. 沙眼病原研究: IV. 接种鸡胚、分离病毒. 微生物学报, 1956, 4: 189-210.
9 汤飞凡, 张晓楼, 黄元桐, 等. 沙眼病原研究: V. 沙眼病毒分离技术的改进. 中华医学杂志, 1957, 43: 81-86.
10 黄元桐, 王克乾, 汤飞凡. 沙眼病原研究: VI. 几种新抗生素及胆汁、胆盐对沙眼病毒的影响. 中华医学杂志, 1957, 43: 765-767.
11 郭秉宽. 新中国十年来的沙眼研究. 中华眼科杂志, 1959, 9:334-336.
13 张晓楼, 金秀英, 王克乾. 分离培养的沙眼病毒人体感染观察.中华医学杂志, 1960, 46: 25.
14 Chang HL, Ch in HY, W ang KC. Experimentaltrachom a in hum an
volunteer p roduced by cu ltured v iru s. Ch in M ed J, 1960, 80: 214-221.
15 张文华, 武宇影, 樊尚荣, 等. 母婴沙眼衣原体感染追踪观察. 中华眼科杂志, 1994, 30: 357-359.
张晓楼教授
张晓楼、金秀英老师等在猴眼做沙眼感染动物实验
87年师兄论文答辩时请来张晓楼、李凤鸣、梁树今、袁佳琴等教授做答辩委员。
听张老讲沙眼衣原体发现的过程.
1988年与梁教授合影。
是张的恩师。毕老当时近70岁的老人，患有糖尿病，身体肥胖，被造反派按着跪在台上，气喘吁吁。张老心里很难受，但又毫无办法，只好暗地里叫科里的一位护士（该护士爱人是医院里的造反派头子之一）搬来一张椅子让毕老坐着挨斗......。同时张老以某种理由，尽快结束批斗会..............。
听说沙眼病原体的分离，最初技术上的突破主要是黄元桐独立完成的。他当时是实验室一小技术员，得出阳性病原结果后报告给了汤飞凡。汤飞凡教授当时是领导，行政事务上占用了很大时间，面对黄元桐的可重复结果，他自己有些不敢做主，就把主要从事临床工作的张晓楼教授拉进来壮大声势。文章发表时的作者顺序，黄元桐排到了第三位。后来沙眼病原体的分离研究获得了不少奖项，但是黄元桐的名字很少被提及。
协和57年之后相当一段时间里也是佞幸当道
沙眼病原体的发现
沙眼是一种古老的眼病, 世界性广泛流行, 曾是致盲首因, 严重危害人类健康。自 19世纪初, 沙眼病原问题即受到微生物界、眼科学界极大重视。
记得80年代中期读研究生时随导师出门诊，某天我在门诊手术室一上午做了5台眼科小手术，完了跟导师说：今天有点累了，做了5台手术。导师说：做这么几台小手术就叫累呢？想到解放初期，在同仁医院做住院医那几年（49-52年），在门诊上班，我几乎每天都要做20几台倒睫矫正术……..
研究历史人类沙眼最早的记录起始于公元前3400 年, 即埃及的基辅 ( Khefu)时代, 当时有记载关于沙眼临床症状的描述即倒睫症。沙眼( trachoma) 来源于古希腊语/ 粗糙, 即上睑淋巴滤泡。公元 11世纪阿拉伯医生IbncIsa认为沙眼分为 4 期, 并指出倒睫是沙眼的主要并发症, 称之为埃及眼炎。 1789至 1801年, 拿破仑率领法国军队进攻埃及归来时, 法国士兵将从埃及染上的这种疾病带入欧洲, 随后英国士兵又将该病带入英国。同样, 通过移民途径, 这种疾病又传入了美洲大陆。 1905年, 美国国会批准的修正案中规定移民进入美国前所有人都需要接受沙眼的检查[ 1] 。除了这种疾病的传染性强之外, 其与贫穷、居住拥挤、卫生条件差、缺乏足够的水源供应有关 [ 2]。
在我国沙眼也是一种古老的眼疾, 最早记载开始于黄帝内经, 古时称为/ 粟疮, 又名 椒疮, 明朝哀学渊的眼科全书记为/ 睑生风粟, 即/ 睑间积血, 年久致成风粟, 与眵粘症同, 然睑眵粘睛, 无风粟也, 故此分睑生风粟, 盖胞者上胞, 睑者下睑也。在审视瑶函等眼科书中有 粟疮者, 似疮非疹, 翻开上睑, 细颗业聚, 生于睑内, 如杨梅之状, 其肉与粟米相似, 赤白不定, 多泪难睁。至于治疗方面, 眼科龙木论、目经、银海精微等书记载有利用刀间日铲洗出血, 三、五度, 去根本即痒, 照本症点服不辍, 渐自稀疏 [ 3]。 20世纪 50 年代, 当时沙眼流行范围很广, 据世界卫生组织估计, 当时全世界有超过六分之一的人口患沙眼, 在发病率高的地区, 人口中因该病而失明的超过 1% ,视力受到严重损害的超过 10% 。据当时的调查, 我国的城市沙眼患病率约 25% ~ 30% , 农村沙眼患病率高达 80% ~ 90% , 有十人九沙之说, 其危害可想而知[ 3] 。早期无法解决沙眼问题主要是由于未查明病原体, 因此很多学者针对沙眼病原体进行研究, 主要有 3 种学说, 即病毒、细菌及立克次体感染。 1907年, 细菌学家Halberstaedter和 von Prowazek在印度尼西亚爪哇地区研究发现沙眼患者的结膜上皮细胞内有所谓包涵体存在, 在姬姆萨染色下上皮细胞质呈青蓝色, 内藏不规则的圆形深蓝色颗粒体, 典型的聚集成堆, 像帽子似的覆盖在细胞核的一端。在病变的过程中, 这些蓝色颗粒逐渐消失, 为红色的较小颗粒所代替, 推测这种包涵体就是沙眼的病原体。1910年, Lindner在沙眼患者刮下的组织中发现一种较大的两极深染的蓝色小体, 有的游离在细胞外, 有的在细胞内, 最大的可达到 1微米, 命名为始体 ( Initial body )。细胞内包涵体小时, 则多为少数的始体, 细胞内充满包涵体时, 则多为原体 ( Elementary body) [ 3] 。 1912年 Nicolle等研究证明沙眼的病原体是可以过滤的。他们采用改良的BerkefeldV滤器, 把沙眼患者的刮取物过滤, 再将滤液接种在猴眼, 使猴患上沙眼后, 又接种在一位已盲目的自愿者眼中, 结果这位被接种者也患上了沙眼, 由此得出结论: 沙眼的病原体是一种可过滤的病毒。该结果在 1935年由 Thygeson和 Proctor重新做了滤过实验, 即将沙眼患者刮下的物质研碎, 用火棉胶膜滤过, 将滤液接种在猴子眼内, 结果这只被接种的猴子患上了沙眼, 结论得以证实。同年, 他们与 Richards从患严重沙眼的印第安小孩的眼内, 刮下上皮并研碎, 破坏细胞膜后, 先用普通的粗滤纸过滤, 除去细胞碎屑, 之后再用直径 0. 6 微米小孔的火棉胶膜过滤, 将滤液分成 3份: 第 1份接种在血琼脂等培养基上, 结果为阴性, 无微生物生长; 第 2 份用离心机离心后, 取上清涂片检查, 经姬姆萨染色, 可找到很多沙眼原体; 第 3份接种于一位 50岁女性自愿者的正常眼, 先将结膜刮擦, 滴入约 1. 6 毫升滤液, 再轻轻摩擦结膜, 经过 5 天潜伏期后, 该妇女患上一种急性结膜炎, 并有大量包涵体和游离始体存在, 诊断为沙眼。 6 周后, 该女性患者角膜有典型血管翳, 结膜变化和临床经过均为典型的沙眼, 经 1年多治疗才痊愈。其后又有很多的实验证实沙眼的病原体是一种可过滤性病毒 [ 4] 。
1938年 Thygeson检查了 320例沙眼患者, 共分为 10组 (表 1), 发现在沙眼开始时 100% 可以找到包涵体, 于急性期多为原体, 并且原体的数量与疾病的轻重成正比, 而在沙眼的后期包涵体的发现率明显减少。 1951年日本学者伊藤报道用电子显微镜检查沙眼组织中取得的滤过液, 可见很多小体, 大小约 60~ 250 纳米, 5人接种该滤液, 其中 4 人感染沙眼, 因此有关沙眼的病原体被认为是滤过性病毒, 但是也有实验得出了阴性结果。 1927年日本眼科学家野口英世在新墨西哥从 5 个未经治疗的印第安人沙眼患者中分离出一种多形态的杆菌, 该菌微小而不产生芽孢, 有荚膜, 能运动, 有鞭毛, 革兰染色阴性, 长约 0. 8~ 1. 2 微米, 一端有一根鞭毛, 为兼氧性, 在半固体培养基中, pH 值 7. 8, 15~ 30度下发育良好, 其培养物可引起猴和猿的颗粒性结膜炎。由于这些细菌可引起人和动物发生类似沙眼的滤泡性结膜炎, 所以野口英世认为这种颗粒性杆菌是沙眼的直接病原。但是, 后来经过各国专家的 74 次反复实验均先后否定了野口氏颗粒性杆菌为沙眼病原体的观点, 原因是这种细菌接种在喉咽后, 虽然引起滤泡性结膜炎, 但是无瘢痕化, 并且不是每个患者中都能找到该细菌。
1934年 Thygeson曾证明包涵体和立克次体有相同的性质, Busacca认为沙眼病原体是立克次体, 定名为 R ickettsiatrachomatosa, 主要是形态学相似。Cuenod等用二期沙眼的颗粒内容移植在冰箱内保存 2 天、于无菌状态下孵化的虱, 应用 Carrels穿刺接种法, 4 天后将该虱磨碎, 用生理盐水中作成乳剂注射在一位盲人的结膜下, 5 天后该患者即发生黏膜肥厚和细小的颗粒, 其表皮刮片和泪液中有点状和小帽状的包涵体和游离的立克次体。6周后, 结膜呈现典型的第 1期沙眼症状 (未提及以后是否发生瘢痕和角膜变化 )。但是, 此后很多学者使用同样的培养方法, 结果则为阴性, 从而否定了立克次体是沙眼病原体之说。
20世纪早期眼科学家、细菌学家及病理学家都参与了对沙眼病原体的研究, 以包涵体、颗粒杆菌及立克次体为主要发现, 但是经过无数的实验和探索, 始终未能解决问题。由于在世界各地都很难找到野口氏颗粒性杆菌, 而实验的结果又多不确实, 尤其是以人类接种但并未出现沙眼的情况, 因此之后无人再探讨。立克次体也因为虱的接种不能完全成功, 而沙眼患者的威-斐反应与其他已知的立克次体疾患相差太远, 所以也被人放弃。仅包涵体学说仍被学者们认可, 但是包涵体究竟是何物, 生物还是非生物? 若是生物, 则是否为一种特别的生物? 抑或滤过性病毒或立克次体?
沙眼病原体的发现20世纪 30年代, 我国微生物学家汤飞凡看到沙眼对国人的危害, 即已开始了沙眼病因的研究。他和眼科周诚浒教授合作从 227例沙眼患者取材, 做了数百次细菌培养, 均未能分离出颗粒杆菌。采用野口原颗粒杆菌菌株接种 12名志愿者 (包括汤飞凡自体眼 ), 但是人体感染试验无沙眼病变,猴眼感染实验也为阴性结果; 以颗粒杆菌为抗原做凝集试验发现 沙眼患者与非沙眼患者无差别; 因此汤飞凡教授否定了沙眼病原的细菌学说。此后, 由于日本侵华战争的影响, 中断了我国沙眼研究的进程。
中华人民共和国成立以后国内烈性传染病基本控制,防疫重点转向多发、常见传染病。当时我国沙眼流行猖獗,防治问题未能解决。汤飞凡教授计划重新继续开展沙眼病因的研究, 1954年他与时任北京同仁医院眼科主任兼副院长的张晓楼教授协商共同合作, 由张晓楼教授负责临床检查、提供临床标本, 汤飞凡教授主持实验研究。他们接受前 人失败的经验, 首先从包涵体研究入手, 因为包涵体形成是病毒等细胞内寄生的微生物感染的特征, 制定了科学的采集活动期沙眼标本的方法, 即选择 201例活动性的、无并发症且未经治疗的典型沙眼病例做结膜刮片, 带回生物制品研究所实验室, 经染色后于显微镜下检查, 证实沙眼结膜刮片可查见包涵体。将包涵体阳性的沙眼材料接种到 1只健康猴子眼内, 使其感染沙眼, 证明了包涵体的感染性。在猴体感染实验中, 共接种了 6 只猴子, 其中 3 只获得阳性结果。在这 3只感染阳性的猴子中, 2只找到了包涵体。此发现纠正了以往认为猴子患沙眼不产生包涵体的错误观点 [ 5, 6]。
随后他们开展沙眼病毒的分离实验。根据1951年日本学者荒川报道小白鼠脑内注射、1953年北村用绒毛尿囊接种鸡胚的方法分离沙眼病毒, 他们从 68例沙眼患者中采集材料, 通过不同方式接种了 2500多只小白鼠, 观察发病过程和病理改变, 但结果都是阴性, 实验似乎进入了绝境。但是,汤飞凡教授认为鹦鹉热病毒是可以在鸡胚卵黄囊中生长的微生物, 沙眼病毒与其形态相似, 也可能在鸡胚卵黄囊中生长繁殖, 因此决定接种鸡胚卵黄囊分离病毒。他们分析了影响病毒分离的因素, 认为除了选择敏感动物、适宜的感染途径、慎重选择无其他并发感染或继发感染的沙眼病例外, 还需抑制杂菌生长。人结膜囊存在正常菌群, 如果在不除杂菌的情况下将标本接种鸡胚后, 细菌将大量繁殖, 在病毒生长之前鸡胚就已经死亡, 因此他们决定在标本中加入抗生素作为抑菌剂, 而当时病毒分离常采用青霉素和链霉素作为细菌抑制剂。随着鸡胚分离实验的多次重复, 他们终于在 1955年 8月 18日第 8次分离试验中分离出了 1株沙眼 / 病毒!
这是世界上第一株沙眼病毒, 被命名为 TE8, T代表沙眼,E 代表病因, 8是第 8次试验。虽然分离出病毒, 但成功率太低, 后来才知道是因为青霉素能杀死 病毒。因此, 他们改进了方法: 取消了青霉素, 加大了链霉素的量, 延长了链霉素在标本中的作用时间, 明显提高了成功率。采用改进的方法, 使病毒分离率达到了 50%，不到两个半月内又连续分离出 8株病毒, 证明试验成功。后来, 许多国家的实验室将其称为汤氏病毒。 1956 年分离出的 TE55株作为沙眼病毒的标准株, 在全世界范围使用。随后他们证明病毒能在鸡胚中继续传代, 用其感染猴能造成典型的沙眼并可找到包涵体, 能将其从猴眼里再分离出来, 得到纯培养。他们还用分级滤膜证明病毒是可过滤的, 并测出病毒颗粒直径为 120~ 200 nm [ 7-10] 。分离出沙眼/ 病毒后, 要确认这种微生物是沙眼的病原体应按照科赫定律要求: 第一, 要能从相应的病例中分离出这种微生物; 第二, 要能在体外传代培养出这种微生物; 第三, 所分离出的微生物要能在健康宿主中引起典型病变和症状; 第四, 能从接种者再分离出这种微生物。根据这个原则, 此次实验采用的是临床未经治疗的Ò期沙眼, 从鸡胚培养获得的沙眼病毒与沙眼患者的材料一样能感染猴眼, 引起特异性病变, 并能在感染的猴眼中找到包涵体和重新分离出病毒, 沙眼/ 病毒在补体结合反应上与性病淋巴肉芽肿病毒有相互交叉反应, 并且沙眼病毒抗原与沙眼患者血清起阳性反应[ 11] 。
为了进一步验证分离获得的沙眼病原体, 汤飞凡和张晓楼教授决心做自体实验, 以证明分离的病毒对人眼的致病性。 1958年 1月和 2月课题组分别将 TJ16 株病毒( 1957年 10月北京同仁医院沙眼小组分离出的病毒, 经鸡胚传 9 代后保存 10周 ) 接种于汤飞凡的左眼睑结膜内, 将 TE16株病毒 ( 1956年 9月生物研究所实验室分离出的病毒, 经鸡胚培养传 16代后保存 18个月 )接种于张晓楼的左眼睑结膜内。接种后逐日行眼部检查, 记录发病情况。结果他们的接种眼都急性发病, 表现急性滤泡性结膜炎、角膜浅层点状浸润, 伴患侧耳前淋巴腺肿大。两位科学家在患眼高度红肿、充血、流泪的病况下忍受痛苦坚持从自己病眼重复取材检验, 先后自汤飞凡病眼结膜刮片取材查包涵体 5 次, 4次阳性, 取材分离/ 病毒10次, 2次阳性; 自张晓楼病眼结膜刮片取材查包涵体 13次, 8次阳性, 取材分离/ 病毒 8 次, 4次阳性。临床发病和实验检查结果都确凿地证实了分离的沙眼/ 病毒 0为沙眼病因。接种后 23 天、41 天, 他们才分别开始治疗。张晓楼教授的左眼结膜上穹隆部从此留下了沙眼瘢痕[ 12, 13] 。 1957年由汤飞凡、张晓楼、黄元桐等署名的沙眼病毒分离成功论文在我国《微生物学报》发表后[ 8, 9, 12-14] , 震动了国际微生物学界和眼科学界。美国、英国医学代表团来华访问索取分离的毒株, 课题组送给 Spooner两株冻干保存的毒种 ( TE8和 TE55)。英国 Lister研究所沙眼研究组主任 Collier 博士将其接种鸡胚复苏了病毒, 并按照这种方法在西非冈比亚分离出 1株命名为 G1沙眼衣原体, 从此中国首次分离出的 TE8和 TE55两株毒种被送到世界各国, 成为研究沙眼病原体的标准株。由于沙眼和鹦鹉热及鼠蹊淋巴肉芽肿的病原体同属介于细菌与病毒之间的一组微生物, 1973 年国际微生物学分类将鹦鹉热-沙眼-性病淋巴肉芽肿这组长期被命名为病毒的微生物从病毒中移出, 改称衣原体目, 沙眼病毒正式改名为沙眼衣原体 ( Chlamydia trachomatis)。从此, 世界各地不断有采用中国的实验方法成功分离出沙眼衣原体的文献报道。此后每 5年世界科学界召开 1次国际性会议, 深入开展沙眼衣原体的研究。现已认识到沙眼衣原体还可引起人体其他多种部位的感染, 造成多种多样的疾病, 如男性尿道炎、附睾炎, 妇女宫颈炎、子宫内膜炎, 婴幼儿肺炎, 母婴衣原体传播等[ 15]。沙眼衣原体感染已成为一种重要的性传播疾病, 引起医学界的极大关注。总之, 沙眼病原体的发现是对医学研究领域的重要贡献, 是微生物学家和眼科学家密切合作与共同努力而创造的中国医学史上的重要成就之一。
参考文献
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2 M ecaskey JW, Knirsch CA, Kum aresan JA, et a.l The possibility of
eliminating b lindingtrachom a. Lan cet In fect D is, 2003, 3: 728-734
3 吴文华, 沈玉清. 实用沙眼防治学. 上海卫生出版社, 1956. 617
4 邹子度. 沙眼的病原. 中华眼科杂志, 1953, 3: 90-103.
5 汤飞凡, 张晓楼, 李一飞, 等. 沙眼病原研究: I. 沙眼包涵体的研究. 微生物学报, 1956, 4: 1-14.
6 汤飞凡, 张晓楼, 李一飞, 等. 沙眼病原研究: II. 猴体传染实验. 微生物学报, 1956, 4: 15-23.
7 李一飞, 卢宝兰, 张晓楼, 等. 沙眼病原研究: III. 病毒分离试验. 微生物学报, 1956, 4: 25-32.
8 汤飞凡, 张晓楼, 黄元桐, 等. 沙眼病原研究: IV. 接种鸡胚、分离病毒. 微生物学报, 1956, 4: 189-210.
9 汤飞凡, 张晓楼, 黄元桐, 等. 沙眼病原研究: V. 沙眼病毒分离技术的改进. 中华医学杂志, 1957, 43: 81-86.
10 黄元桐, 王克乾, 汤飞凡. 沙眼病原研究: VI. 几种新抗生素及胆汁、胆盐对沙眼病毒的影响. 中华医学杂志, 1957, 43: 765-767.
11 郭秉宽. 新中国十年来的沙眼研究. 中华眼科杂志, 1959, 9:334-336.
13 张晓楼, 金秀英, 王克乾. 分离培养的沙眼病毒人体感染观察.中华医学杂志, 1960, 46: 25.
14 Chang HL, Ch in HY, W ang KC. Experimentaltrachom a in hum an
volunteer p roduced by cu ltured v iru s. Ch in M ed J, 1960, 80: 214-221.
15 张文华, 武宇影, 樊尚荣, 等. 母婴沙眼衣原体感染追踪观察. 中华眼科杂志, 1994, 30: 357-359.
张晓楼教授
张晓楼、金秀英老师等在猴眼做沙眼感染动物实验
87年师兄论文答辩时请来张晓楼、李凤鸣、梁树今、袁佳琴等教授做答辩委员。
听张老讲沙眼衣原体发现的过程.
1988年与梁教授合影。
是张的恩师。毕老当时近70岁的老人，患有糖尿病，身体肥胖，被造反派按着跪在台上，气喘吁吁。张老心里很难受，但又毫无办法，只好暗地里叫科里的一位护士（该护士爱人是医院里的造反派头子之一）搬来一张椅子让毕老坐着挨斗......。同时张老以某种理由，尽快结束批斗会..............。
是张的恩师。毕老当时近70岁的老人，患有糖尿病，身体肥胖，被造反派按着跪在台上，气喘吁吁。张老心里很难受，但又毫无办法，只好暗地里叫科里的一位护士（该护士爱人是医院里的造反派头子之一）搬来一张椅子让毕老坐着挨斗......。同时张老以某种理由，尽快结束批斗会..............。
听说沙眼病原体的分离，最初技术上的突破主要是黄元桐独立完成的。他当时是实验室一小技术员，得出阳性病原结果后报告给了汤飞凡。汤飞凡教授当时是领导，行政事务上占用了很大时间，面对黄元桐的可重复结果，他自己有些不敢做主，就把主要从事临床工作的张晓楼教授拉进来壮大声势。文章发表时的作者顺序，黄元桐排到了第三位。后来沙眼病原体的分离研究获得了不少奖项，但是黄元桐的名字很少被提及。
协和57年之后相当一段时间里也是佞幸当道