4. Minor points:文章用bacteria codon 的construct在真核细胞表达蛋白，能有表达真心不容易。如果用humanized codon，效果岂不更好？文末作者declare no financial interest，如果这个东西将来有大用途了，还不能有专利呀，太失策了。
4. Minor points:文章用bacteria codon 的construct在真核细胞表达蛋白，能有表达真心不容易。如果用humanized codon，效果岂不更好？文末作者declare no financial interest，如果这个东西将来有大用途了，还不能有专利呀，太失策了。
plus, I don't know which plasmid you checked for the 14 TtAGO but the following one doesn't seem to contain his tag at C term. http://www.addgene.org/53079/sequences/
I also looked at the first 2 pages of addgene ago plasmids but didn't find any with C-term tag(some of them even specifically indicate N-term tag). Not sure which Ago plasmids are with c-tag that you found.
【 在 ZhuWL () 的大作中提到: 】 Ago 半路插进来说一下，刚刚听说Ago C末端不能多任何序列呢。。。。 不过在addgene上查了一下，不但14年TtAgo在c末端有多了几个序列还有6*his标签，然 后在addgene上搜索ago，在搜到的结果里，随便找几个质粒，各种tag，各种标签，c末 端哦，sv40，flag，his。。you name it....... 所以楼主是不是获取的信息上有什么错误。。。
，而自己也在试着重复。
对于这片文章，我本人有一下几点疑问，看看那位高人能解答一下：
1.一般来说Ago蛋白C端加tag，无论是来自于那个物种，蛋白就没有活性了，主要由Ago蛋白自身结构folding决定。文中用的几个construct，好像只有1-2个C端是没有tag的
。那么，用C端带tag的Ago作出的实验，是否有意义呢？当然，不能够排除NgAgo本身特殊，能够tolerate C端tag，只是从预测的结构上讲，可能性很小。
2.Ago催化酶切的核心domain实际是一个RNaseH fold，催化cleavage时应该结合双链（无论DNA或RNA），而双链其中一个是guide，另外一个是target。我无法想象gDNA
guided NgAgo是如何切割双链DNA的。文章开始用2个guide，也许还有些道理（说不定
细胞DNA会有瞬时的单链状态）；后来直接上一个guide也能行，确实比较神奇。当然，不能够排除NgAgo本身特殊，就是能够切双链，只是从其类似蛋白结构上讲，可能性很
小。
3.文章说如果同时转入Ago表达质粒和gDNA，就能行。如果先转Ago质粒，8小时候再转
gDNA，就不行。这里我无法理解。难道先转Ago质粒8小时候，这个质粒就不表达了？如果继续表达，那8小时候再加gDNA跟同时一起转细胞又有什么区别呢？难道
transfection效率太低，以至于2次transfect的东西无法进入同一细胞，因而不行？至少从这个角度来讲，文章的一个主要figure的结果有点奇怪。
4. Minor points:文章用bacteria codon 的construct在真核细胞表达蛋白，能有表达真心不容易。如果用humanized codon，效果岂不更好？文末作者declare no
financial interest，如果这个东西将来有大用途了，还不能有专利呀，太失策了。
希望大家轻拍。
两个比较通用的质疑：
LZ提的第一点，非常的武断。就算真有这方面的研究，随便说到"无论来自于那个物种
，蛋白就没有活性了。" 这种结论是很难随便做的。Tag种类也很多。
第4点，所谓原核、真核code的质疑。只是一个usage的问题。能够表达太正常了。
1.一般来说Ago蛋白C端加tag，无论是来自于那个物种，蛋白就没有活性了，主要由Ago蛋白自身结构folding决定。文中用的几个construct，好像只有1-2个C端是没有tag的
。那么，用C端带tag的Ago作出的实验，是否有意义呢？当然，不能够排除NgAgo本身特殊，能够tolerate C端tag，只是从预测的结构上讲，可能性很小。
有没有paper报道在Ago蛋白的C端加tag会使其活性消失或者降低？最好在这里列几篇参考文献。因为我以前对于好几个蛋白质在C端加FLAG,GFP，都不会影响蛋白的功能，对
于Ago家族的蛋白，我不了解。
2.Ago催化酶切的核心domain实际是一个RNaseH fold，催化cleavage时应该结合双链（无论DNA或RNA），而双链其中一个是guide，另外一个是target。我无法想象gDNA
guided NgAgo是如何切割双链DNA的。文章开始用2个guide，也许还有些道理（说不定
细胞DNA会有瞬时的单链状态）；后来直接上一个guide也能行，确实比较神奇。当然，不能够排除NgAgo本身特殊，就是能够切双链，只是从其类似蛋白结构上讲，可能性很
小。http://www.nature.com/nature/journal/v507/n7491/full/nature12971.html
Tt-Ago 确实是一次只能切ssDNA造成nicking，这篇文章的figure中使用了一对5‘-P-
siDNA guides（FW and RV）。
3.文章说如果同时转入Ago表达质粒和gDNA，就能行。如果先转Ago质粒，8小时候再转
gDNA，就不行。这里我无法理解。难道先转Ago质粒8小时候，这个质粒就不表达了？如果继续表达，那8小时候再加gDNA跟同时一起转细胞又有什么区别呢？难道
transfection效率太低，以至于2次transfect的东西无法进入同一细胞，因而不行？至少从这个角度来讲，文章的一个主要figure的结果有点奇怪。
这个有可能是两次转染对于细胞的伤害太大。既然同时转染能行，为什么要分步转，逻辑不通。
4. Minor points:文章用bacteria codon 的construct在真核细胞表达蛋白，能有表达真心不容易。如果用humanized codon，效果岂不更好？文末作者declare no
financial interest，如果这个东西将来有大用途了，还不能有专利呀，太失策了。
这个human code optimization好像不会特别影响结果，我之前在查那个用于阴性筛选
的DTK基因就没有经过人源化的优化，也能够起作用。
我还是很担心这篇文章有问题，现在闹得这么大，万一一旦被大家确证不可重复的话，对于国内的科研单位甚至于在海外的华人都将产生无法估量的影响。虽然说日本的小保方晴子的造假貌似对日本科研界影响不大，但是中国国情不一样，老外本身就是带着有色眼镜看中国。希望不要出问题。
tRNA都很多，没必要，特别在年均实验经费3万，各种variants都靠PCR from strain的情况下。
做法就是解释
另外NgAgo并不能切单链DNA，这一点和TtAgo就完全不同。
看了一下论文，作者先转Ago，然后分别在12h和24h转gDNA，fig 2b显示12h无影响，但是24h load的gDNA明显减少。
作者的解释是NGAgo 装载gDNA可能需要在翻译折叠的阶段进行，所以如果后转染gDNA可能导致体内已经成熟的Ago无法结合gDNA，这也解释了为什么体外纯化的Ago蛋白无法在37C装载gDNA，而只能55C装载，代价是可能导致蛋白部分失活变成一个Nikase。
另外作者在supplemental里面也提到了可以通过再次转染gDNA的方法提高效率。
所谓“装载gDNA可能需要在翻译折叠的阶段进行”解释就说不通，因为无论何时转gDNA都有正在翻译折叠的NGAGO来结合gDNA的。“再次转染gDNA提高效率”的现象难道不是
和先后转gDNA和NGAGO的结果相悖么？
其实说多无益，做出来才是硬道理。
感觉比较怪。始终觉得不会有这么绝对。
你的这些质疑，都不是很Solid的质疑。Opinions的东西远远大于Facts.
致后转的 gDNA loading效率下降的问题。
再次转染说的是knockin实验，推荐在24小时的时候再次转gDNA是为了让更多的新合成
的Ago和gDNA结合，能起多大作用不知道，但并不矛盾。
NGAGO结合gDNA以及切割DNA的机制不清楚，肯定得继续接着做。
说来说去，其实没有任何证据表明Ago家族蛋白不能接C-Term tags. Tag种类很多，和
蛋白间的Linker设计有时候也很关键。
你都重复了一周的实验？ 你从头合成的质粒？
你干脆说是你韩paper的reviewer好了，一年以前就知道这个事。
这帮人跑这里造谣是什么心态？ 完全捞不着任何好处啊。
还是怕被人肉？
不管哪个原因，都够猥琐的
明明说了是讨论science，有些人非要扯上一下无关的东西，有本事说点跟文章内容直
接相关的？不要老是含沙射影的，实在是没劲。
要故意刁难的话，你说啥paper我不能写上三页纸的comments？
说此话人当时主要是在回忆自己以前发的文章，有些没发到最好journal，当年觉得不
平不公；可回过头来看，自己现在觉得应该可以做得更好。所以有感而言，虽然
reviewer当初可能有些故意刁难，现在觉得反而对自己的science是个鞭策，因此他现
在的目标就是做到完美让人无话可说。
本就没有逻辑关系。科学史上性格张狂怪癖但又牛逼闪闪的人多了去了...
你把你做的方法和实验结果贴到这里去嘛，如果是因为韩春雨所说的需要高超的技巧（等我笑一会），说不定会有人给你提出修改意见，其他的同行业可以直接跟你交流。
2.文章没有使用活性缺失的ago做control，韩看到的“突变”是否有可能是ago
cleavage independent？因为韩用的C末端加tag的ago不应该有酶活性的。
3.听闻11g说2月后可能有对韩工作的明确定论。难道他们结构要出来了？
plus, I don't know which plasmid you checked for the 14 TtAGO but the
following one doesn't seem to contain his tag at C term.
http://www.addgene.org/53079/sequences/
I also looked at the first 2 pages of addgene ago plasmids but didn't find
any with C-term tag(some of them even specifically indicate N-term tag). Not sure which Ago plasmids are with c-tag that you found.
给个链接？
【记录历史】谁重复验证了NgAgo？
收集到3则“重复实验证实韩春雨组NgAgo基因编辑功能”的信息，
实例详细信息请参见：http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/32034437.html
其中：
- 1则出自“火锅哥”
o 发布人“做的中间发现了一个问题，才发现韩点播的很有道理”，实验“调整了
步骤，这在韩的paper里没有提”, 实验结果“关键是测序也和韩的报道能温和”
o 发布人许诺2016年7月22日前发布重复结果到BioRxiv
o 截止到2016年8月24日，仍无发布消息
原文链接http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/32028091.html
鉴于"科学的事情要由科学来解决”，而且Nature杂志有可能发表关于Replication实验数据的文章， 建议发布人
- 尽快发布重复验证NgAgo实验结果
- 并联系Nature Biotechnology，尽快以publication形式公布重复验证NgAgo实验数据
- CoinByCoin
2016-08-24
学术讨论就是能吸引到最多关注。
- “澳洲哥”在第二次重复实验，无法验证NgAgo基因编辑功能之后，希望NBT文章原作者写一个详细的protocol并参与group discussion来帮助大家troubleshoothttps://twitter.com/GaetanBurgio/status/769120770219843585
- 业界很多同行也无法重复验证NgAgo基因编辑功能http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/32034437.html
- 而由于“火锅哥”了解如何调整protocol而观察到韩春雨实验室NBT里的NgAgo基因编辑功能
请“火锅哥”也和业界同行分享实验调整细节，帮助业界同行troubleshoot
原文链接http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/32028091.html
原文引用
“做的中间发现了一个问题，才发现韩点播的很有道理。
于是调整了步骤，这在韩的paper里没有提。恰恰是这一步调整，后续平行结果虽说
variation很大，但平均值已经比较客观。关键是测序也和韩的报道能温和。”
不给出reference paper也不给出PDB ID，只是说有文献，有结构。。。。这样真的很
不能让人信服啊。
我不是做RNAi这一行的，好奇去搜了一下PDB，找到一个Human Argonaute2结构，4Z4D
，看了一下，C端是折叠在蛋白内部，不暴露在外的。如果所有的Ago蛋白都是这样折叠的，那倒的确支持楼主的说法。但如果lz说的是“Ago蛋白的C端疏水，折叠在蛋白内部，在C端加Affinity tag会影响正确折叠进而影响活性”，那大家看了一目了然，不就
没有那么多疑问了吗。
Title：以Argonaute核酸酶为核心的基因编辑技术 （中国专利号CN 105483118 A）
Links: https://www.google.com/patents/CN105483118Ahttps://www.google.com/patents/CN105483118A?cl=zh
Key Points：
- 沈啸、韩春雨 （浙江大学）Ago基因编辑专利发表
- 特别注明：
1. 专利filing date：Dec 21, 2015
2. 根据专利描述，不但NgAgo有基因编辑功能，HpAgo、NaAgo和NtAgo “都与NgAgo一
样有很强的编辑哺乳动物细胞内基因表达的能力”；以及MaAgo，NpAgo，NIESAgo，
SchAgo，SPAgo “等Argonaute核酸酶也能在37°C编辑DNA”
这些类型的蛋白质多不多？
的Tag-Ago。
看看带Tag的Ago会不会形成有活性的结构？
从经典的生化实验中，我们可以看到，对于一个蛋白，特别是一个酶，一定要有非常好的，稳定性，重复性都很高的assay，才能真正地了解它的功能与特性。
每个好的assay，都是酶的真实功能的显示。
如果一个酶缺乏一个assay想要测到的功能，不是assay没设对，就很可能是这个酶没有这个想要达到的功能了。
比如Taq酶，其实它的一个很好的assay，也是它的应用，就是PCR。
这个assay 很robust， 成功率很高，应用就广了。
Taq酶辅助了PCR， PCR成就了Taq酶;
Cas9这个酶也是相似的，加上 CRISPR成为一个系统，CRISPR/Cas9也有一个很好的
assay， 也是它的应用， 这就是基因编辑了。
这个assay 也很robust， 成功率也很高，应用就更广了。
CRISPR/Cas9辅助了基因编辑，基因编辑也成就了CRISPR/Cas9
从现在这么高的不可重复的几率来看，韩春雨的NgAgo/gDNA,用基因编辑的assay来测量，无法测到基因编辑的功能，更别谈robust和重复性了。
用基因编辑的assay测不出来，那么韩春雨的NgAgo/gDNA有没有基因编辑的功能，就要
被打上一个大大的大问号了。