20年前的蛋白多肽类药物药代动力学分析方法

1　蛋白多肽类药物的分析方法

1.1　生物检定法
　　由于蛋白多肽类药物多为有生物活性的物质,且生物活性不仅取决于药物的一级结
构，与二 、三级结构亦密切相关，故生物检定法是研究该类药物动力学独特而必需的
方法。生物检定 法 有两个目的，直接测定体液中药物浓度及鉴定标记药物的生物活性。其方法主要可分为两大 类。
1.1.1　在体分析　常规的有胰岛素的小鼠血糖法等，另外还有根据各 类蛋白多肽的生物活性 不同而建立的各异的方法，如根据IL-8可将大量中性粒细胞从骨中动员出的性
质［1］ 而建立 的IL-8动员中性粒细胞家兔体内实验。这类方法最直观地反映生物活
性，但涉及整体动物 ，费时费力，灵敏度不高，变异较大。
1.1.2　离体组织（细胞）分析　如NGF刺激鸡背根神经节增长，缩宫素 的大鼠离体子
宫法等。 随着分子生物学的发展，许多特异性强，灵敏度高的依赖细胞株被建立，细
胞培养已是最常 用的方法。根据蛋白多肽与细胞相互作用的机理不同，具体的操作亦
有多种。如细胞增殖法 （Proliferation assays）,快速灵敏,但特异性稍差; 抑制增
殖法(Antiproliferation as s ays),检测系统简单,灵敏而专一; 减少细胞损伤法(
Cytopathic effect reduction assays ) ［2］,则是依据具有抗病毒活性的药物如干
扰素，保护细胞不受病毒损伤, 方法直观 灵敏, 但 可能会受到多肽亚型的干扰。以上的方法都是以细胞数目的增减为量效指标，计数方法有直 接计数法和间接计数法，后
者包括MTT法，同位素（3H,14C）掺入法 等。此外，还有根据蛋 白多肽与细胞间接作
用进行检测，如与免疫检测联用的抗体诱导法［3］，结合酶反 应的酶诱 导分解法［4］等。总的说来，细胞培养法多具有灵敏特异，客观可靠的优点，但其 不足也显 而易见。首先，生物检定法无法定量失去活性的小代谢物，无法示踪它们的体内动态；其次 ，样品多存在于人或动物血清中，血清中内源物质的干扰以及可能存在的内源因子的
交叉反 应，影响了方法的专属性；再者，启动生物过程常需阈量细胞因子从而降低了
方法的灵敏度 ；依赖株细胞长期培养易发生变异而影响检测的特异性。
1.2　免疫学方法
　　免疫学方法是利用蛋白多肽药物抗原决定簇部位的单克隆或多克隆抗体特异地识别被检药物 ，再以放射计数，比色等方法予以定量，即将特异的抗原抗体反应配以灵敏
检测的方法。常 用的方法有三种。
1.2.1　放射免疫法（Radioimmunoassays RIA）　该法是被测药物（Ag ）,标记药物（多为125I-Ag）与抗体（Ab）的竞争性结合反应，方法的特异性 取决于抗原抗体的亲和力及标记药 物的纯度，与生物检定法相比，有简明，易于控制的优点。
1.2.2　免疫放射定量法（Immunoradiometrec assays IRMA）　该法中 被测药物依然
是Ag，它 先与固定相上的Ab形成Ab∶Ag复合物，再与标记抗体125I-Ab结合，形成Ab∶Ag ∶125I-Ab夹心 状。由于Ag需有两个Ab来识别，这就大大增加了方法的特异性，是
一灵敏而低变异的方法， 只是对标记抗体的纯度要求很高。
1.2.3　酶联免疫法（Enzyme-linked immunosorbent assays ELISA）　ELISA的原理与IRMA相 似，只是第二个抗体不是用碘标，而是用可以与底物发生显色反应的酶如HRP来标记，与上 述两法相比，ELISA具有使用寿命长，重复性好，无辐射源的优点，并且已有不少实验证明 ，它与生物检定法具有一定的量效关系［4］及相关性［5］，提示它
可部分地 反映药物的生物活性。
　　免疫学方法的缺点在于它测定的是蛋白多肽的免疫活性而不是生物活性；不能同时测定代谢 物，且具有抗原决定簇的代谢片段可能增加结果误差；不同来源的抗体与相
同的蛋白多肽反 应可能有较大的差别；还可能受到内源物质的干扰。但免疫法毕竟是
一种迅速，灵敏，适于 批处理的方法，已有数十种蛋白多肽被开发成能满足药物动力
学研究的商品药盒。目前临床 药动学领域，免疫法已逐渐取代生物检定法。
1.3　同位素标记示踪法
　　放射性同位素标记技术是研究蛋白多肽在生物体内处置的一种最常用的方法。所使用的同位 素有125I, 99mTc, 3H,14C, 35S 等，其中125I因比放射性高，半衰期适宜，标记制备简单 而最为常用。标记方法有两种，一是内标法，即把含有同位素的氨基酸
加入生长细胞或合成 体系，该法对生物活性地影响可能较小，但由于制备复杂而限制
了其广泛应用；二是外标法 ，常用化学方法如氯胺T或Iodogen法将125I连接于大分子
上，因相对简单而被首 选。
　　同位素法具有简便直观，检测迅速的优点，尤其适用于蛋白多肽药物的组织分布研究，但其 缺点亦显而易见。首先，它不能进行人体药物动力学研究；其次，同位素标
记后是否会引起 药物的生物活性及其在生物体内的代谢行为发生变化，一直存在争议
．前者可通过调整反应 条件和生物检定法加以改善和验证，基本上可使生物活性无明
显变化；后者因药而异则复杂 的多，已有报道认为［6］，放射性标记法可干扰表皮生长因子与细胞的相互作用， 从而导致 其体内清除的紊乱；最后，由于蛋白多肽进入体内会被降解代谢，或与其它蛋白质结合，总 的放射性不能代表药物动力学过程，因此
如何鉴别样品的原药，降解物及结合物是该法中需 解决的关键问题，目前常用的方法
有两种。
1.3.1　SDS-PAGE法　根据药物Mr的大小选择不同浓度的凝胶电 泳，通过控制电流等条件使得原 药与其它产物分开，然后通过切割胶条放射计数或放射自显影的方法，来检
测电泳放射性图 谱。该法具有较高的分辨率和灵敏度，但电泳过程中，125I-小肽和游离 125I可能扩散至空白凝胶或电解液中，从而使结果可能偏高。
1.3.2　HPLC法　高效反相色谱（RHPLC），高效排阻液相色谱（SEHPLC ）［7］，高效离子交换液相色 谱（IEHPLC）分别根据保留时间与蛋白多肽的疏水-亲水性特征，Mr大小，极性的 关系 来分离样品中的物质。它们共同的优点是特异性高，分辨率好，可同时测定原药和降解物， 其中SEHPLC亦可得到结合物的信息，而RHPLC用于蛋白多肽的分离有独特的优越性。但因受 注入样品量的限制，灵敏度，重现性都受影响，且设备昂
贵，成本较高。
1.4　色谱法
1.4.1　HPLC　在进行普通药物动力学研究中，HPLC是技术成熟，应用广 泛的分析手段。在蛋 白多肽药物的实验研究或产业化中，HPLC都是主要的分离纯化工具。但鉴于蛋
白多肽药物结 构的特殊性，除了一些小分子多肽，如peptichemio［8］，加压素的八
肽拮抗剂（oc tapeptid e antagonist of vasopressin）［9］可分别直接或经选择性柱反应后,单独 用带荧光检测 器的HPLC进行药动学研究外，HPLC常需进一步改进或与
其它更灵敏的检测技术联用方能满足 药动学的需要。除了上述提及的与同位素的联用
，还有许多与免疫学方法的联用，如Philli ps［10］采用免疫亲和色谱技术分析人三
种不同体液中粒细胞集落刺激因子的浓度； Partilla ［11］等认为HPLC与RIA联用可
以检测人体液中的神经肽。此外，令人瞩目的还有液 ／质在线联用（LC-MS）。
　　LC-MS将高分离能力，适用范围广泛的色谱分离技术与高灵敏、专属及通用,在研究蛋 白多肽的结构中具有重要价值的质谱法联用起来，成为强有力的分离分析方法。多
年来限制 LC-MS技术发展的决定因素是接口问题，由传送带接口（Moving-belt
interface），热喷 雾 接口（Thermospray），到最近的电喷雾离子化接口（
Electrosptay ionization ESI），联 用技术日趋成熟，尤其适用于生物样品中低浓度（pg/ml）药物及代谢物的测定［12］ ，而蛋 白多肽类药物恰有在体内代谢快，浓度
低的特点。国外已将用LC-MS于该类药物，药物代 谢 物［13，14］的动力学研究，国
内尚处于起步阶段，除了仪器本身价格昂 贵，技术上亦存在 一些问题，如它对样品的纯度要求很高如何将药物从生物体液，尤其是血浆中提取纯化以 减少干扰；如何选择
合适的内标以减少系统误差；在将LC-MS用于检测体育禁用肽(HCG,HGH ,EPO,ACTH等)时发现，糖肽难用于质谱分析，因为在质谱条件下，同样的氨基酸序列可产生 多种不同
质量的多糖链，而每条链及整个分子都有可以产生质谱信号，这就大大降低了质谱 信
号的专属性。目前，尽管LC-MS在蛋白多肽药物的体内药物代谢动力学研究中还存在一 定的难度，但其作为实用性强，前景好的领域已引起人们的广泛关注。
1.4.2　高效毛细管电泳（HPCE）　HPCE是离子或荷电粒子以电场为驱动 力，在毛细管中按其 浓度和分配系数不同进行高效，快速分离的新技术，它以高分辨率，高灵敏度
，分析时间短 ，样品量少及操作简单等诸多优点而成为蛋白多肽生物分子分离分析的
重要手段。在临床 上 ，生物体液中低浓度蛋白多肽的分析面临的问题有：蛋白多肽与毛细管壁的相互作用所引起 的迁移时间的改变，这可以通过涂层CE加以改善；由于毛
细管很细，管内容积很小，进样量 的不易控制给实验的重复性带来影响，而且很可能
无法对低浓度的样品提供足够的灵敏度。 近年来，国外根据样品的性质采用不同的预
处理，大体上可分为非特异性和高亲和性两种， 将样品加以浓缩，取得了满意的效果
［15］。HPCE在检测上的迅速发展与HPLC已有并 驾齐驱之 势，况且鉴于HPCE在样品微量分析的优越性，已有人在药物动力学研究、体内分析中，将微 透析连续采样与之联
用［16］，这在整个药动学研究中都不失为一有希望的方向。 2　结　语

　　由以上可知，现代科学技术的发展给蛋白多肽类药物的研究提供了多样的分析手段，但鉴于 该类药物的特殊性，目前尚无一种方法能完全满足动力学研究的要求。根据
人用药物注册国 际协调会议（ICH）对生物药物临床前安全性评价“在科学基础上的灵活性和具体情节个别 处理”的总则，人们通常将几种方法联合应用，互相补充，才能
得到比较可靠的结果。

张琪（中国药科大学药代中心，南京 210009）
王广基（中国药科大学药代中心，南京 210009）