抛砖引玉,说一下laboratory diagnosis of COVID19

Cytochrome
楼主 (北美华人网)
最近因为去中国的检测要求,版上不少关于各种检测的讨论,我来说一下 molecular test, antigen test 和antibody test, 抛砖引玉,如果有错的地方, 请大家原谅。 我现在用的是工作的laptop, 敲中文很不方便,也请大家原谅。
分子检测 分子检测是测病毒的RNA, 大部分test的原理是 reverse transcription real time PCR, 少部分利用其他核酸扩增原理,比如transcription mediated amplification (Hologic fusion), iso-thermal amplification (Abbott ID Now), nested PCR (FilmArray RP panel)等等。
根据FDA 网站, 目前有7个test被批可以用于point of care(POC)检测,就是说不需要highly regulated laboratory, 可以用在urgent care setting, 对检测人员的要求没有那么严格。其中Abbott ID now 的run time只有15分钟,是POC test 里面最快的,很多地方管这个叫rapid test, 多用来在急诊收治病人的时候screening.
一些commercial tests, 大的in vitro diagnostic 公司研发的测试, 或者是高通量,或者是moderate complexity,只需要非常少的labor,  run time 差不多1-3 个小时,目前这些test platform都是on allocation by governmental agencies.
另外一种归于laboratory developed test, 核酸提取,扩增,分析结果到出报告,turn around time 至少6-8个小时, 这种test只能在CLIA certified clinical laboratory to perform high complexity test的地方测试,测试人员也有相应的要求。
任何检测假阳假阴都会发生,分子检测相对来说analytically sensitive和specific, 但它们的clinical performance还需要学习, pre-analytical factor (specimen collection, specimen type, collection time, collection personnel…),  analytical factor (carry-over contamination…), post-analytical factor (clerical error…) 都会影响结果。 看一个test只看sensitivity 和specificity是不够的,还要看predictive value, 这个value 会根据disease prevalence而变化。 举一个极端的例子,有个covid 19 antibody test做validation的时候用pre-pandemic  serum 当作true negative specimen,  4/1000的positive, 结论是specificity 99.6%, 很棒对不对? 但是在prevalence为0的情况下,这个test 的positive predictive value 是0。 同样的情况也是可以发生在分子检测里。
目前FDA批很多EUA 给molecular tests, 8月份fda给所有的EUA makers 邮寄了一个panel, 用来比较不同test的 analytical performance, data 公布在fda网站,有兴趣的可以看看, 挺有意思的, 都是分子检测, limit of detection 可以差出最多1000 fold. https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-covid-19-and-medical-devices/sars-cov-2-reference-panel-comparative-data
Antigen test 检测病毒的抗原,比如nucleocapsid protein, spike protein… 这个检测有各种platform, 一般用在POC, 15分钟出结果,也叫rapid test, 不需要专门的实验室, physician office, CVS 什么的都可以做。Antigen test 的敏感性和特异性都比分子检测差很多, 目前FDA批了7个test,  这些test 在发病5天以内的symptomatic patients 上的表现还是很不错的,但是对于asymptomatic individual, performance就很差,所以现在业界不推荐用于asymptomatic individual who has no known exposure,比如大学返校screening, 会造成false security的感觉。
Antibody test 检测身体免役系统对病毒感染的反应, 一般来讲IgM 出来的早一点,5- 7天after infection, 但是特异性差, 容易cross react with other viral infection, 所以目前FDA 批的IgM非常少, 很多实验室不offer, IgG 出来的晚, 特异性高, 敏感性在感染14天以后,immunocompetent individual里,可以超过95%, 总的来讲,antibody test confirms past infection.
要不要测, 什么时候测, 用什么方法,测什么specimen type, 不同的情况,答案是不一样, 这里有片很早的paper发在JAMA, 如果有兴趣, 值得看一下
https://jamanetwork.com/journals/jama/fullarticle/2765837
先说道这里, 想起什么我再补充。看在我辛苦码子的份子上,如果有不同意见,请文明讨论,谢谢大家。
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inimeg
就友情提醒下,用工作的laptop上华人不太好吧
pignanny
mm说的非常好啊,谢谢科普
Cytochrome
就友情提醒下,用工作的laptop上华人不太好吧
inimeg 发表于 2020-11-19 15:20

谢谢提醒,平时没事不一定一直没事,今天是工作得烦了,拿手机发帖又麻烦。。。
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cliu706
Abbott Now 据说不是用的PCR,楼主知道是用的什么方法吗?
summerline
mm写得很好呀,手动点赞!
doorsopen
回复 1楼Cytochrome的帖子
谢谢你辛苦码字! 我想问一下,如果我要和一个完全不懂医学的人解释和确诊案例接触后14天隔离要怎么解释好?有很多人在期间测了是阴性,就不愿意隔离满14天了. 还有一些人持续测阳性,虽然已经经过治疗并且无症状了,这些人还有感染性吗?
faramita
Abbott Now 据说不是用的PCR,楼主知道是用的什么方法吗?
cliu706 发表于 2020-11-19 16:53

恒温扩增,不需要PCR那样做高低温循环,大概就一直保持60多摄氏度,但都是核酸扩增。
Cytochrome
Abbott Now 据说不是用的PCR,楼主知道是用的什么方法吗?
cliu706 发表于 2020-11-19 16:53

具体我也不懂,我只知道用enzyme打开cDNA双链, 所以叫isothermal amplification, 而PCR是用高温 95C
Cytochrome
回复 1楼Cytochrome的帖子
谢谢你辛苦码字! 我想问一下,如果我要和一个完全不懂医学的人解释和确诊案例接触后14天隔离要怎么解释好?有很多人在期间测了是阴性,就不愿意隔离满14天了. 还有一些人持续测阳性,虽然已经经过治疗并且无症状了,这些人还有感染性吗?
doorsopen 发表于 2020-11-19 17:57

这个不好说哎,incubation time 平均3-7天, 最长的我看到的有17天发病(当然不能排除中间被感染的可能), 所以现在普遍隔离14天, 从获得感染到有足够的detectable 病毒是需要时间的,测试阴性不能完全排除幡感染。 目前的study常用viral culture positivity来估计感染性,PCR Ct value 超过33以后,基本上都culture negative, suggest not infectious,这个还有待时间的证明。流行病学研究,发病7 天(不记得具体数字了)以后, 免疫正常的人是基本上没有感染性,哪怕是分子检测持续阳性。
doorsopen
这个不好说哎,incubation time 平均3-7天, 最长的我看到的有17天发病(当然不能排除中间被感染的可能), 所以现在普遍隔离14天, 从获得感染到有足够的detectable 病毒是需要时间的,测试阴性不能完全排除幡感染。 目前的study常用viral culture positivity来估计感染性,PCR Ct value 超过33以后,基本上都culture negative, suggest not infectious,这个还有待时间的证明。流行病学研究,发病7 天(不记得具体数字了)以后, 免疫正常的人是基本上没有感染性,哪怕是分子检测持续阳性。
Cytochrome 发表于 2020-11-19 18:12

谢谢,很有帮助!
doorsopen
这个不好说哎,incubation time 平均3-7天, 最长的我看到的有17天发病(当然不能排除中间被感染的可能), 所以现在普遍隔离14天, 从获得感染到有足够的detectable 病毒是需要时间的,测试阴性不能完全排除幡感染。 目前的study常用viral culture positivity来估计感染性,PCR Ct value 超过33以后,基本上都culture negative, suggest not infectious,这个还有待时间的证明。流行病学研究,发病7 天(不记得具体数字了)以后, 免疫正常的人是基本上没有感染性,哪怕是分子检测持续阳性。
Cytochrome 发表于 2020-11-19 18:12

发病7 天(不记得具体数字了)以后, 免疫正常的人是基本上没有感染性,哪怕是分子检测持续阳性。
这个能具体讲讲吗?如果有症状是不是还是有感染性?
婉约2020
这种帖子越多越好,手动点赞👍
Cytochrome
发病7 天(不记得具体数字了)以后, 免疫正常的人是基本上没有感染性,哪怕是分子检测持续阳性。
这个能具体讲讲吗?如果有症状是不是还是有感染性?
doorsopen 发表于 2020-11-19 18:18

不好意思,这个我并没有特别读相关的文献, cdc 有个return to work criteria, 基本上如果还是symptomatic 是应该隔离的, 没有症状了,具体多少天才不传染,我也说不好
https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/return-to-work.html
doorsopen
不好意思,这个我并没有特别读相关的文献, cdc 有个return to work criteria, 基本上如果还是symptomatic 是应该隔离的, 没有症状了,具体多少天才不传染,我也说不好
https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/return-to-work.html

Cytochrome 发表于 2020-11-19 19:04

谢谢!
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inimeg
我也班门弄斧瞎说几句。 黄金标准应该是核酸检测(分子检测)。下面讨论的情况都是不考虑取样是否到位的情况。因为核酸检测本质上是PCR扩增,而PCR扩增的原理是用一个小的片段的引物(根据每种病毒序列而设计的)来扩增,所以提取的样品里有没有能结合这段引物的片段就决定是否阳性。当然如果携带完整病毒有传染性自然会检测阳性(如果取样也没差的话)。但有些人得了好长时间,可能体内还有核酸片段而非完整病毒,可能恰好这段核酸片段就包括结合引物的片段,这样也能测出阳性。这种到底有没有传染性呢?真想知道的话需要取样做细胞感染的实验,显然这种实验要求很高(好像是p3还是p4的),因为能感染细胞也能感染做实验的人...而且也很费钱,所以除非研究需要,临床诊断似乎很少做。 我的印象是目前并没有一个conclusive的结论,到底几天后就没有传染性了,或者得了很久仍然是阳性是否有传染性,以及传染性是否和症状有关。官方的guideline大家就看看就完了,感觉主要是各公司用来甩清责任的,cdc还说要密接15分钟以上才能得呢。唯一能给出的建议还是自己小心吧。
Cytochrome
我也班门弄斧瞎说几句。 黄金标准应该是核酸检测(分子检测)。下面讨论的情况都是不考虑取样是否到位的情况。因为核酸检测本质上是PCR扩增,而PCR扩增的原理是用一个小的片段的引物(根据每种病毒序列而设计的)来扩增,所以提取的样品里有没有能结合这段引物的片段就决定是否阳性。当然如果携带完整病毒有传染性自然会检测阳性(如果取样也没差的话)。但有些人得了好长时间,可能体内还有核酸片段而非完整病毒,可能恰好这段核酸片段就包括结合引物的片段,这样也能测出阳性。这种到底有没有传染性呢?真想知道的话需要取样做细胞感染的实验,显然这种实验要求很高(好像是p3还是p4的),因为能感染细胞也能感染做实验的人...而且也很费钱,所以除非研究需要,临床诊断似乎很少做。 我的印象是目前并没有一个conclusive的结论,到底几天后就没有传染性了,或者得了很久仍然是阳性是否有传染性,以及传染性是否和症状有关。官方的guideline大家就看看就完了,感觉主要是各公司用来甩清责任的,cdc还说要密接15分钟以上才能得呢。唯一能给出的建议还是自己小心吧。
inimeg 发表于 2020-11-19 20:01

mm你说的很有道理,从analytic的角度来讲,核酸检测有最高的敏感性和特异性,不过从clinical performance来讲,目前没有gold standard,negative 核酸测试不能exclude感染。
terriblewind
赞知识!
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cliu706
回复 8楼faramita的帖子
这个准确率怎么样?