本钱老手把手教中专生做mRNA疫苗

步骤1：从冷库中提取DNA

质粒应该是已经有了。。。。没有就从addgene买，再没有就从genescripts定，但哥一般从buildmyvector订，老中开的，做的快，寄的慢，但一般200不到，10kb都可以合成。质粒可以放室温，稳定。

步骤2：促使细胞成长繁殖

“涵盖了质粒的细菌将会被装在实验瓶中，并且在一种温暖无菌的琥珀色生长培养基的烧
瓶中生长与繁殖。lol 不就麻痹lb broth么

步骤3：发酵混合物（细菌）

发酵你麻痹，细菌能叫发酵么？

质粒转化 top10， 本钱老一半从thermo定冰冻的top 10， 10e6 subclone 量级就可以了，冰上20分钟42度30秒，冰上在2分钟，涂版。第二天挑单克隆， 小管子预培养6-8 小时，回家前放250ml 加amp等抗性，摇过夜。

步骤4：采集并净化DNA

发酵过程在经历了四天后，研究人员将会往里注入一种化学物质来分解细菌的细胞壁，随后会净化混合物，并且最终提取到仅留的质粒。

lol 大抽，买kit 本钱老不给老板省钱，一般买qigene

步骤5：质量检测

被提取出来的质粒将会被技术人员通过和之前的样品进行对比，以确认刚刚生产的质粒的病毒基因序列并未出现变异，并且能够被用于生产疫苗。

nanodrop 看230/260 比列，1.8左右就可以了，本钱老一般1.9

步骤6：切割质粒

如果质粒顺利通过了质量检测，技术人员将会再往混合物里面加入一种为酶的蛋白质。加入这种酶素的主要目的是把环状质粒切割开来，把病毒基因从环状状态切割成直线段。以上过程又被成为线性化，大约需要两天时间完成。

梅切， ecorI 加hindIII，20分钟， 跑胶 回收，本钱老，估计作者的意思是再把线性片段装到T7promoter 质粒上做体外转录，加点ligase搞定。

这里，本钱老，觉得有t7promoter的 引物，做pcr更好，更纯净，还能dilute细菌里面的毒素

步骤7：净化DNA

纯化？买个endo+的kit就可以了，地道点，酒精洗一遍，异丙醇洗一遍，离心，晒干。溶于elution buffer （ph平衡的盐水）

步骤8：运输

冻起来，干冰上

步骤9：进行DNA到mRNA的转变

这步本钱老再试验室是第一把好手，ambion的kit用的飞起，2个小时结束，最后用 300 一大瓶的trizol 收 100ng给你最后1mg/ul来个30ul

步骤10：mRNA检测

测序 5刀一个。nanodro 看看 230 260 本钱老一般大于2.

步骤11：冷藏、打包和再次运输

干冰。

步骤12：准备mRNA

化

步骤13：准备脂质

同时，另一个步骤也在进行，准备脂质（Lipids）——这种物质能保护mRNA进入人体细胞时不会被破坏。

lol lipofectamine 本钱老，现做，基于是打人，本钱老推荐fugene ，毒性小。

步骤14：制作mRNA疫苗

20分钟，5ul lipofectamine 放dmem里面，mrna混dmem里面 过五分钟一混，等20分钟

步骤15：准备疫苗瓶

分装，转六孔板。

步骤16：罐装疫苗

同上

成品的疫苗结构

步骤17：打包、冷藏和测试

放eppendorf 管子里

步骤18：打包和运输成品疫苗

数周的测试后，合格的疫苗可以运输了。盒子里装上了温度计，实时监测温度是否达标。每个盒子里有45磅的干冰。

冻！！！

最后一步：打疫苗

一半美国人，超过1.4亿，已经至少注射了一针疫苗，绝大部分都是mRNA疫苗。这是洛
杉矶一个巨大的体育场，变成了疫苗注射点。

感染细胞，

结束。。

太jb简单了，本钱老2天的实验。