下一步你可以照韩老师NBT文章 supplementary data里面general protocol (Protocol of NgAgo/gDNA-mediated genome editing and examination (T7E1 assay) and a representative experiment) 来一遍。
里面有非常详细的说明。
【 在 joshhaha () 的大作中提到: 】 我手里用的是韩老师送来的NgAgo DNA (N). 1。 我们设计了CAS9-gRNA plasmid (C) & Podicin promotor-GFP plasmid (P) using lipo-fectamine 2000 co-transfection into podocyte. Podicin is only specifically and weakly expressed in podocyte.当然，我们也加了neomycin选择. 按照设计思想，只有Podicin promotor-GFP 正确编辑插入，才可以看见绿色。我们确 实可以看见微弱绿色荧光。基本吻合设计思路。 2。然后我把 NgAgo&gDNA & (P) using co-transfection into podocyte. 我们也可以看见微弱的绿色。 请问， 下一步应该怎么验证？请详细说明。不要乱喷。我是做实验。 希望可以有所发现 ...................
请问， 下一步应该怎么验证？
希望可以有所发现
非常感谢！
我把原文修改一下，防止泄露更多细节。
representative experiment) 来一遍。
里面有非常详细的说明。
为了应付各种质疑，正在准备各种control.
希望几个月以后可以定下结论。
podocin连续拼错三次
不能下结论。所以需要等待
希望几个月以后可以定下结论。
说三年之后下结论多好。
你是自己跑测序胶么？
只要我能重复改进，并且验证是正确的。我就有很大的收获。呵呵。
心情不错，但是最担心的是测序了。
大家的一致意见，测序和各种control.一定要用最严谨的科学结果。千万不要让
同行挑毛病。
大量的时间压缩到最少量的工作中去。
田大学取消其以前获得的博士学位。此外，受到牵连的小保方晴子的导师笹井芳树自杀。尽管受到这些重创，但小保方晴子一直坚持，STAP细胞具有真实性，STAP细胞制备方法的论文是正确的，其自杀的导师笹井芳树也在遗书中嘱咐小保方晴子“一定要再现
STAP细胞啊”……
现在，尽管小保方晴子还没有再现STAP细胞，但瑞士研究人员的研究结果似乎在支持小保方晴子此前的研究结果。对于细胞重新编程产生诱导的多能干细胞，相当多的研究人员认为，物理和化学的多种方法都可以影响和促成这类干细胞的形成。挤压这种简单（实则并不简单）的方式同样可以影响和促成干细胞的生成。
瑞士的研究人员采用物理挤压的方法把成体细胞诱导为干细胞，这种突破显然比小保方晴子此前的酸处理和挤压方式更简单，结果也更惊人。结果的突破源于认知的突破。过去研究人员对干细胞的传统培育方法是利用细胞培养皿或细胞培养瓶等二维方法来进行。但是，机体的细胞是在三维环境中生存的。因此，瑞士研究人员研发了一种新方法来模拟三维环境的细胞培养，这就是一种特殊的凝胶。把正常细胞置于包含正常生长营养物质的特殊凝胶中，就可以达到模拟活体组织中的三维环境。
通过调整干细胞周围凝胶的组成（硬度和密度），凝胶就会对细胞行使驱动力，通过“挤压”来使其转变成为干细胞，因为这种方式和过程可以对细胞进行快速而且有效的重编程。三维环境可以产生机械性信号，并且同特殊的遗传因子相互作用从而使得细胞更加容易地转变成为干细胞。
小保方晴子的研究思路显然与瑞士研究人员是一致或相似的，因为在研究中小保方晴子发现，细胞在经过各种处理后会表现出类似干细胞的表现，这些处理方式包括加热、酸处理和挤压等，最后发现用酸处理和挤压效果比较好，能让成体细胞转变为与诱导的多能干细胞相似的STAP细胞。
挤压让细胞重编程产生干细胞的原理似乎简单，但是，操作起来并不那么容易，所以，以小保方晴子介绍的相同方式，其他研究人员并未能得到重复的研究结果。现在，瑞士研究人员的结果似乎重复了小保方晴子的研究结果。但是，谁又能重复瑞士研究人员的这一研究结果呢？
于是，问题的结局有两个。一是有更多的研究团队来重复瑞士研究人员的研究结果，并因此而为小保方晴子洗冤。另一个结果是，后续的多项研究并不能重复瑞士研究人员的挤压产生干细胞的结果，也因此又有可能是类似小保方晴子的结局。
一针见血。
为 Gibco”，“293T细胞贴壁不牢，换液时要小心操作”，“溶解和稀释质粒及
gDNA 的缓冲液变更为水（pH 8.0）
实在忍不住爆下粗口，我操，耍人也要有点诚意行吗？joshhaha，替我问候下你老婆，等你身败名裂了，也许出于人道主义我可以出钱让你家隔壁老王照顾她一下。
"韩老师，professor"...
Smart2.0， 诸如此类的事情真的很Low，还有你那些tricks, 不要到是你的真实水平如此还是在下一盘大棋，那些所谓绝招真的显得智障。
初次意外，几个建议：
1， 冒充的时候要更改语气，你看你这次做的又不好了，太容易被看穿。
2，这都什么时候了，你每天还在百度贴吧里逛，虽然没发帖，但是你看到你的状态啊
（半夜2-3点）， 你赶紧去忙着补实验擦屁股吧， 现在还有空逛贴吧？
大家建议，是赶紧发小文章，占个位置。
还是等一等，做一些生物学意义的实验，发相对好点的文章。
请大家参谋一下，不要乱喷。
谢谢
如果等发不错的文章，估计其他组有人已经宣布可以重复。我们就落后了。
如果抢先去做国际会议报告如何？宣布我们可以重复，然后等一等发好文章，怎么样？
不过切记不要先发，你先发了领导就认为生米已成熟饭，就不理你了。
楼主，你还没回答我，你是要做Knock-in吗？
如果测序不对，后者对照有问题，就白高兴了。
不过，根据设计思路，应该是很有希望的。
我肯定不会再这里公布任何细节了，只是告诉大家，看见希望了。
以后只能说，是否有进展，再也不提细节了。
非常感谢楼上几个同学的提醒。我之前有点兴奋过头了。
不应该说太多。已经被行内人批评了。
希望大家理解。
韩说有20多家，或者6，7家能重复，又不肯公布单位，说是怕坑了人家，其实是一家都没有，完完全全胡编乱造信口开河的下流无耻小学六年级水平的谎话。
老天爷保佑，hope 测序和对照正确。
我已经投入了2个月，天天重复和修改实验方法。
不过，假如测序结果不能证实的，我也认为是有问题。
但是，确实看见promising results.
不说了，赶紧看文章了。
本来只是想做个科研的探讨，结果现在爆炒的这么火。
据说还有风投讨论这个话题。我昨天被同事训了， 我说的太多了。
所以，赶紧过来修改各种细节。
幸亏之前说的不清楚。
做科研的人，不能单纯的做科研，也要学会保护自己的知识产权。
不好意思了。
你们会看见咱们中国人本土的发现，是很激动人心的。
呵呵
的高手太多了。不能泄密。
好吧不管怎么样，下周还是报一下测序结果吧，不要让我破灭了幻想
相信我，确实看见了很兴奋的结果，而且是大家一起看的。
测序要等一下。我现在细胞需要扩增，然后测序。起码2周以后的事情了。
sequencing will be correct.
如果不是因为你太忽悠人，乐意帮你的人不会少的
科学界不是工业界，工业界只要不犯法就OK,你把大米卖成人参的价格算你有本事, 科
学界还是讲究科学精神的。
幸亏有人提到保密details 的事情。我才立刻醒悟过来。赶紧修改原文。
每一步我都清清楚楚的告诉大家了。包括我的想法的改变。
君子坦荡荡阿，呵呵
让我更对测序充满渴望和紧张。呵呵
这是实话。
看见，这类话在这里早已经饱和。可以考虑把你以后的这些话集中在百度新宋米兰那些吧。对你而言，效果会比在这里说好。
但是细胞扩增时候，没有发现阳性。因为是从一个孔转到175 里面，扩增了几次，估计丢失不少细胞。依然决定做继续提取细胞。
同时决定直接在10厘米的盘里直接转染，不扩增了。
只要可以拿到一点阳性细胞，就可以测序了。
很明显，可以重复实验的。
我现在必须要防止假阳性。
已经和几个这方面的高手在讨论这个问题。
根据设计，是不会出现的，但是必须要防止，所以，又设计了几个对照实验
这样做出来的结果更加严谨。
正在设计更多的对照，防止除问题。
版上关于您的负面新闻太多了， 看着是不是很痛苦，吓得拉肚子了么？
别管他们，玩你自己的，没事弹弹琴，放松一下，做科研的人里面，你是琴弹得最好的。
期待您的用古琴超声波修饰DNA的大作。
你重复别人实验的时候，会这么讲话吗？